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上海酶聯生物研究所
上海酶聯生物研究所
閱讀：1614發布時間：2010-4-17
目前，纖維素是zui豐富的可再生有機資源，其生物降解主要由微生物——細菌和真菌完成。細菌主要產中性纖維素酶和堿性纖維素酶，這類酶制劑對天然纖維素的水解作用較弱，長期以來沒有得到足夠的重視。但原核生物的基因一般不含內含子，可直接從基因組DNA中克隆到目的基因用于工程菌的構建。因此細菌纖維素酶基因的克隆，既利于研究纖維素酶基因的多樣性，也利于纖維素酶基因工程菌的構建。隨著中性纖維素酶和堿性纖維素酶在棉織品水洗整理工藝及洗滌劑工業中的成功應用，以及耐熱性纖維素酶在燃料酒精生產中應用，細菌纖維素酶制劑已顯示出良好的應用性能和巨大的經濟價值。
2 纖維素分解性細菌的類群
纖維素分解性細菌是指能分解纖維素的細菌，分三大類群：（1）厭氧發酵型：芽孢梭菌屬（Clostridium）、牛黃瘤胃球菌屬（Ruminococcus）、白色瘤胃球菌（Ruminococcusalbus）、產琥珀酸擬桿菌（Bacteroidessuccinogenes）、產琥珀酸絲狀桿菌（Fibrobactersuccinogenes）、溶纖維菌（Butyrivibriofibrisolvens）、熱纖梭菌（Clostridiumthermocellum）、解纖維梭菌（Clostridiumcellulolyticum）；（2）好氧型：糞堿纖維單胞菌（Cellulomonasfimi）、纖維單胞菌屬（Cellulomonas）、纖維弧菌屬（Cellvibrio）、發酵單胞菌（Zymomonas）、混合纖維弧菌（Cellvibrimixtus）；（3）好氧滑動菌，如噬胞菌屬（Cytophaga）。
3 細菌纖維素酶基因的克隆與表達
細菌中編碼纖維素酶的基因在基因組的分布為隨機的或形成基因簇。在基因簇中，有轉錄終止子，沒發現有啟動子。人們已從40多種細菌中克隆到了纖維素酶基因，其中一些酶基因已經在大腸桿菌和酵母中得到表達。如從Stropyomyces、Clostridium、Thermoanaerobacter、Themomonspora、Erwinia、Pseudomonas、Cellvibrio、Ruminococcus、Cellulomonas、Fibrobacter和Bacillus中成功分離出葡聚糖基因，并先后克隆了瘤胃的Bacteroides、succi nogenes、ButyrivibriospRuminococcusalbus等細菌的纖維素酶基因，同時熱梭菌中的11種內切纖維素酶（CelA、CelB、CelD、CelE、CelF、CelG、CelH、CelI、CelJ、CelK、CelS）的基因已經被克隆，嗜纖維梭菌的5種內切纖維素酶（EngA、EngB、EngC、EngD、EngE）已經測序并在大腸桿菌中得到表達。楊智源、劉永生、游銀偉等從不同的細菌中克隆了內切葡聚糖酶基因[1-3]。Kim等克隆了AquifexaeolicusVF5編碼EG的ce18Y基因，在E.coliXL1-Blue中成功表達，Hakamada等運用盒式連接介導PCR和反向PCR克隆到了基因egl-257。人們將纖維素酶、纖維二糖等外源基因轉入運動發酵單胞菌（Zymomonasmobilis）中并得到不同程度的表達，有望將它改造為能將纖維素轉化為乙醇的重組菌株并在工業中廣泛應用。細菌葡聚糖酶基因在S.cerevisiae的啟動子和信號肽的控制下構建在同一質粒載體上，然后轉入S.cerevisiae，重組菌可向培養基分泌保留70%活性的葡聚糖內切酶和外切酶，這種酶能夠分解濾紙和木漿中的纖維素。
4 細菌纖維素酶分類
細菌纖維素酶是多酶復合體系，根據各酶的功能可分為三大類：（1）內切葡聚糖酶（1,4-D-glueanohydrolase或endo-1,4-β-D-glucanase，EC3.2.1.4），簡稱Cen。作用于纖維素內部的非結晶區，隨機水解β-1,4-糖苷鍵，將長鏈纖維素分子截短，產生大量非還原性末端的小分子纖維素，其分子量大小約為23-146KD。（2）外切葡聚糖纖維二糖水解酶（1,4-β-D-glucancellobio-hydrolase或exo-1,4-β-D-glucanase,EC3.2.1.91），簡稱Cex。作用于纖維素線狀分子末端，水解β-1，4-D-14糖苷鍵，依次切下一個纖維二糖分子，故又稱為纖維二糖水解酶（cellobiohydrolase），分子量約38-118KD。（3）β-葡萄糖苷酶（β-1,4-glucosidase,EC3.2.1.21）簡稱BG或稱纖維二糖酶。這類酶一般將纖維二糖或可溶性的纖維糊精水解成葡萄糖分子，其分子量約為76KD。
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