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技術文章

培養細胞的免疫酶標抗體染色法

閱讀:470發布時間:2012-2-16

免疫酶組織化學技術是以酶作為抗原抗體反應的標記物,酶催化相應的 底物,形成一種不溶性的反應產物。光鏡觀察時,要求形成的終產物為不溶性的有色沉淀, 而電鏡觀察時,則要求酶反應的終產物經適當處理后,具有較高的電子密度。辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)是目前應用zui多的酶標記物,具有穩定性強和酶反應特異性高等優點。

1)0.1mol/LPB(pH 7.2)配制的4%多聚甲醛原位固定(4℃)1小時;
2)2%H2O2/甲醇處理(可省略),室溫20分鐘,封閉內源性過氧化物酶活性;
3)PBS漂洗后1%BSA室溫孵育15分鐘;
4)特異性抗體(*抗體)室溫孵育3小時或4℃孵育過夜;
5)PBS充分漂洗后,HRP或*標記的第二抗體室溫孵育30—60分鐘,如系*標記的第二抗體,反應后則需進一步按ABC試劑盒要求操作;
6)PBS漂洗后,1%戊二醛0.1m01/LPB配制固定30—60分鐘,PBS漂洗;
7)呈色反應:0.03%~0.05%DAB 0.0l%H>(L/0.05mol/LTris—HCl(pH 7.6)顯色,適時終止反應,PBS漂洗;
8)1%OsO4后固定30~60分鐘;
9)樣品的脫水、原位包埋、超薄切片制作及電鏡觀察等與常規電鏡相同。

培養細胞的免疫酶標抗體染色法電鏡圖
顯示胸腺細胞表面:thy1.2抗原分布(箭頭所示)


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