*膠囊為*代*類抗生素,臨床上常用于*敏感細(xì)菌所致的急性咽炎、急性扁桃體炎、中耳炎、支氣管炎、肺炎等呼吸道感染、泌尿生殖道感染及皮膚軟組織感染等。此類抗細(xì)菌藥品在進(jìn)行微生物限度檢查時,需采用適宜的方法消除藥物抗菌活性的干擾,才能保證其檢驗方法的科學(xué)性及檢驗結(jié)果的準(zhǔn)確性。
本試驗用2005年版中國藥典規(guī)定的3株細(xì)菌、2株真菌,采用不同的方法對3批*膠囊進(jìn)行了微生物限度檢查方法的驗證試驗,以建立*膠囊的微生物限度檢查方法。
1、材料
1.1儀器：電子天平；臺式低速離心機；集菌儀。
1.2、培養(yǎng)基 營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基、改良馬丁培養(yǎng)基、營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基BL培養(yǎng)基、MUG培養(yǎng)基、pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液。
1.3 供試品：*膠囊批號為200609020060902、20060903）。
1.4菌種：大腸埃希菌[CMCC（B）44102]、枯草芽孢桿菌[CMCC（B）63501]、*LCMCC（B）26003]、黑曲霉[CMCC（F）98003]、白色念珠菌[CMCC（F）98001]。
2、方法與結(jié)果
2.1菌液制備 將上述5株菌的新鮮培養(yǎng)物分別接種至規(guī)定培養(yǎng)基,細(xì)菌培養(yǎng)16h;酵母菌培養(yǎng)24h;霉菌培養(yǎng)5d,制備成菌孢子懸液,備用。
2.2供試液制備 按規(guī)定取供試品10g,加pH7.0無菌氯化鈉-蛋包監(jiān)緩沖液至100ml,在45℃水浴中保溫使囊殼溶解,混勻,即為1:10供試液;按規(guī)定取供試品10g采用無菌操作,將囊殼與內(nèi)容物分離,稱量于同一容器中,加pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100ml,混合均勻,立即吸取混懸液置離心管中,500r•rmin-1離心4min,取上清液為1:10供試液。
2.3細(xì)菌、霉菌和酵母菌計數(shù)方法的驗證
2.3.1取供試液適量和50～100CFU試驗菌,分別注入同一平皿中,傾注相應(yīng)瓊脂培養(yǎng)基后,培養(yǎng)計數(shù),為試驗組;同法取試驗菌加入量,測定所加的試驗菌數(shù),為菌液組;取供試液加入量測定供試品本底菌數(shù),為供試品對照組;按以下公式:回收率%=[（試驗組平均菌落數(shù)-供試品對照組平均菌落數(shù)）÷菌液組平均菌落數(shù)]×100%計算回收率。
2.3.2 霉菌和酵母菌預(yù)試驗 取供試液①1，0.5mL分別注2皿為一組,每組加入1種真菌試驗菌菌液,共2組。1,0.50mL/皿2株菌回收率均為70%以上。
2.3.3 細(xì)菌預(yù)試驗
2.3.3.1 取供試液 ①1；0.5；0.33；0.25；0.2；0.1mL分別注2皿為一組,每組加入1種細(xì)菌試驗菌菌液,共3組。3株菌回收率均為0%。
2.3.3.2 取供試液 ②1；0.50；0.33；0,25；0.2；0,lmL分別注2皿為一組,每組加入1種細(xì)菌試驗菌菌液,共3組。3株菌回收率均為0%。
2.3.3.3 取供試液 ②每10ml離心后的上清液全量加至裝有適量pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液容器中,采用薄膜過濾法,用pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液分次沖洗,在zui后一次沖洗液中分別加入50～100CFU試驗菌,取膜分別貼于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上,培養(yǎng)計數(shù),為試驗組,3株試驗細(xì)菌每膜沖洗200、300mL,其中300mL沖洗量的菌回收率可達(dá)70%以上;菌液組、供試品對照組同法測定。
2.3.3.4 稀釋劑對照組 取pH710無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液適量,共3份,分別加入3株試驗細(xì)菌菌液,使zui終菌濃度50～100CFU/mL,以下操作同2131313。
2.3.3.5 根據(jù)以上試驗結(jié)果,大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌、*采用低速離心加薄膜過濾法,2株真菌采用常規(guī)法1mL•皿進(jìn)行驗證試驗,
