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上海勁馬實驗設備有限公司
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ELISA作為經典的免疫檢測方法，看起來很平常，然而真正做好它并不容易。它究竟有哪些秘笈呢？不要著急，往下看！
1.確定您的樣本類型和試劑盒可以兼容：
常見樣本類型有血清，血漿，細胞培養上清，如果是廠家實驗驗證過的，可根據產品說明購買使用。【注意：血漿制備用到的抗凝劑有 EDTA、檸檬酸鹽、肝素等多種，相應的血漿性質存在差異，需單獨確認兼容性】。
特殊樣本，如尿液、胸腹水、腦脊液、灌洗液、淚液，組織勻漿液等，可能缺乏廠家數據支持，這并不是說試劑盒無法應用于這些樣本，而是需要咨詢有相關經驗人士或自行實驗驗證可行性（如需進行摻入回收實驗）。
2.試劑盒檢測范圍需要匹配樣本中標志物濃度：
ELISA試劑盒的定量檢測范圍需參考標準曲線，在標準曲線zui低和zui高濃度區間內屬于線性范圍，其中的值是可信和可定量的。濃度高于線性范圍的樣品要稀釋到線性范圍內來測量，而濃度低于線性范圍的樣品，其測量值不能用于計算濃度，只能用做參考。有一種常見的相關情況是：健康人樣本中很多標志物的濃度偏低，測量值低于標準曲線zui低值。
3.樣本收集有講究：
以血清為例，樣本收集可參考試劑盒說明書，但需注意以下要點。樣本盡量用無菌管收集，避免細菌的酶類和代謝產品對結果的影響。采集過程要避免溶血，因為紅細胞溶解釋放的活性物質可能會影響檢測。保存過程中如有沉淀，應離心后取上清液。樣本若不立即測定，建議按照每次使用量分裝保存在 -20℃，每次檢測使用一管，即避免交叉污染和反復凍融，有能保證檢測結果的平行可比性。
4.實驗前要準備好相應試劑：
提前將所有試劑平衡到室溫環境，這個過程大致需半小時左右。洗液是濃縮液，如有結晶析出，需*溶解后再進行稀釋。A、B 兩管顯色底物在使用前15分鐘按 1:1 配成混合液。為保證蛋白標準品溶液配制質量，蛋白標準品為凍干粉，重溶前需將管子離心，加入說明書的緩沖液，慢速在搖床上搖勻或顛倒混勻，至少 15 分鐘，不建議用槍頭吹打。溶解后如需保存，按每次使用量分裝后根據說明書要求的溫度保存。梯度稀釋蛋白標準品時，建議用聚丙烯管（對蛋白吸附力很低），每步都要充分混勻且更換新槍頭，確保梯度準確性。
5.儀器設備的準備也*：
相關設備包括移液器、洗板機/搖床和酶標儀。移液器的準確性對于ELISA實驗結果的可靠性十分關鍵，需要確保定期校準維護。搖床的使用是為了讓反應體系快速達到平衡，獲得穩定、可重復的結果。不用搖床對實驗通常的影響是，OD值低，CV大。酶標儀等設備使用前提前 15分鐘開機預熱。
6.預實驗：通常預實驗包括全部標準曲線和小量樣本：
預實驗有兩個主要目的，一來是熟悉實驗流程，發現可能忽略的問題；二來是測試樣本和試劑盒是否匹配，一旦出現不匹配的情況，不至于浪費過多樣本。另外是對樣品中目的分析物的豐度作一下大致了解，以確定合適稀釋度。
7.剩余的試劑盒材料要妥善保存：
標準品分裝后按說明書要求的溫度保存，這樣可以避免污染，對要求冷凍保存的標準品還可以避免反復凍融；酶標板放回錫箔紙袋，加入干燥劑，封緊封口，4℃保存。忌未將酶標板*平衡至室溫，就放回錫箔紙袋，因為此時由于溫度差，酶標板上會有水汽，不利于穩定保存。
8.加樣要快速準確，避免氣泡：
加樣時間宜控制在 15 分鐘內。加樣前要將樣本混勻，特別是凍存后融化的樣本（自然融化的血清等樣本會有分層現象），應上下顛倒充分混勻，注意動作輕緩，避免產生氣泡。如凍存融化后的樣本有沉淀，可以再次離心。整個加樣過程都要注意避免產生氣泡。氣泡會影響蛋白的相互結合，而影響反應進行。
9.孵育時要保證溫度均勻，防止揮發變干：
孵育時壓緊封口膜。多塊板一起實驗時，要平放各板，不要疊放，以免因溫度不均造成漂移或邊緣效應。
10.洗板機的應用：
使用洗板機，不但可以降低勞動強度，而且有利于保證 ELISA 測試的穩定性。目前的全自動洗板機不但具有很多實用的洗滌動作，如底部沖洗，兩點吸液，震動，交叉吸液；還可以根據需要調節沖洗壓力，沖洗距離，沖洗時間等參數。通過優選這些動作和參數，能保證良好的洗滌效果。洗板機的性能對于結果準確性影響也很大，好的洗板機要保證洗板后的殘留液盡可能的少，一般不超過 2μL，以洗滌后用人工拍板墊紙不濕為準。應定期檢查抽吸針頭是否堵塞。洗液如果含有吐溫，應隨用隨配。
11.手動洗板的操作指南：
加洗液要快速，沒有多道移液器可以使用洗瓶。洗液應新鮮配制，以免被其他試劑污染，或染菌。加好洗液后浸泡 30s-1min。甩板倒液要迅速干脆。倒液后在吸水紙上拍板，選用無粉塵和碎屑的吸水紙。需要用力拍板，使孔內沒有可見液體掛壁；但也不能太重，不能讓樣品干太久。酶標板拍干后立即做后續的加液。
12.顯色反應的關鍵點：
ELISA實驗是個酶促底物顯色反應，隨時間增加，顯色變深，所以選擇時間終止反應是得到準確的標準曲線和樣本濃度的重要因素。終止過程要*。使用的 TMB 底物時*終止點是黃色，不會有任何程度的藍色或綠色，終止過程中必要時可以震蕩 96 孔板，或用槍頭抽吸混勻（終止液含強酸，避免腐蝕）。
13.數據分析：
按照說明書推薦的數據分析方法做曲線擬合及分析。說明書中的標準曲線是在廠商的實驗室中，由非常有經驗的操作人員得到的結果。客戶的標準曲線和說明書中的標準曲線可能存在不同，但不等于不好。通常判斷標準曲線合格的標準為：背景OD 值 <0.2；zui高點 OD 值>1.0；相關系數 R2接近或等于1。只要滿足這些條件的標準曲線都是可以使用的。
結語：
當您了解并掌握了ELISA實驗的這些，離做出zui棒的ELISA就只有一步之遙了，接下來不妨在上海勁馬眾多ELISA試劑盒中挑選一款適合您的產品，去獲得穩定可靠的實驗數據哦。
