酵母人工染色體載體

    酵母人工染色體載體（ＹＡＣ）是由ＣＥＮ載體發(fā)展而來的。它的主要組成如下：

（１）著絲粒；

（２）兩個端粒：存在于染色體的末端，使染色體正確地結束復制，防止染色體被外切酶切割；

（３）復制起始位點。ELISA試劑盒

    ＤＮＡ復制的起點染色體結構確定后，可以通過重組ＤＮＡ技術將每一組成部分分離開來，然后連接在一起，創(chuàng)造人工染色體。自然中酵母的染色體有幾百個ｋｂ長度，利用人工染色體可以攜帶比其他質(zhì)粒更大的ＤＮＡ分子。

    ｐＹＡＣ３是在ｐＢＲ３２２的基礎上，插入了幾個酵母基因。其中兩個基因是ＵＲＡ３和ＴＲＰ１，可以作為選擇標記分別存在于ＹＩｐ５和ＹＲｐ７，就像在ＹＲｐ７中一樣，攜帶ＴＲＰ１的同時也包含一個復制起點，但在ｐＹＡＣ３中這一片段擴展到ＣＥＮ４，它是一段來自４號染色體著絲粒的ＤＮＡ片段。ＴＲＰ１ｏｒｉＣＥＮ４片段已經(jīng)包含了人工染色體組成三部分中的兩部分。第三部分端粒，有兩段稱為ＴＥＬ的序列提供，并不是它們自身組成端粒序列，而是在引入酵母細胞核后，作為種子序列建立端粒。還有zui后一部分沒有提到的是ＳＵＰ４，它在克隆實驗中作為插入片段的選擇標記基因。利用ｐＹＡＣ３克隆的策略是，載體首先被ＢａｍＨⅠ和ＳｎａＢⅠ酶切將分子切成三塊，ＢａｍＨⅠ片段被去掉，剩下兩個臂，每一臂都以ＴＥＬ作為末端，另一端是ＳｎａＢⅠ位點。克隆的ＤＮＡ必須是平端（ＳｎａＢⅠ也是一個平端酶，識別序列是ＴＡＣＧＴＡ），被連接在兩個臂的中間就產(chǎn)生了人工染色體。利用原生質(zhì)轉(zhuǎn)化法將人工染色體引入酵母。受體酵母是利用一個雙營養(yǎng)缺陷體ｔｒｐ１-ｕｒａ３，載體上含有互補基因作為選擇標記。轉(zhuǎn)化后于基本培養(yǎng)基上培養(yǎng)，只有含有人工染色體的細胞可以正常生長。含有兩個左臂或者兩個右臂的染色體都不能正常生長，因為其中一個選擇標記基因丟失，插入片段的鑒定可以通過ＳＵＰ４基因的插入失活，白色的克隆是重組子，紅色的不是。ELISA試劑盒

    一些哺乳動物的基因大于１００ｋｂ（如人類膀胱纖維基因有２５０ｋｂ），超過了大腸桿菌載體系統(tǒng)的承受范圍，但正好在ＹＡＣ載體的范圍之內(nèi)。zui近的研究發(fā)現(xiàn)，在某些情況下，ＹＡＣ可以在哺乳動物中表達，因此可以研究哺物動物基因的功能。

    ＹＡＣ在構建基因文庫中非常重要，要知道，zui高容量的大腸桿菌質(zhì)粒可以插入３００ｋｂ的片段，對于人的基因文３００００個克隆，而ＹＡＣ可以克隆６００ｋｂ的片段，一些特殊的類型可以攜帶１４００ｋｂ片段，可以使人類基因文庫的克隆數(shù)降至６５００個。但不幸的是，這樣的“ｍｅｇａ-ＹＡＣ”存在著不穩(wěn)定性，克隆的ＤＮＡ片段可以被重新排列。不管怎樣，ＹＡＣ在大規(guī)模的測序中（例如人類基因組計劃）是非常有用的。ELISA試劑盒