輔酶ⅠNAD(H)含量試劑盒說明書
測定意義：
輔酶ⅠNAD(H)廣泛存在于動物、植物、微生物和培養細胞中，NAD 是糖酵解和 TCA 循環的主要氫受體，生成的 NADH 經呼吸電子鏈傳遞把電子交給氧，在合成 ATP 的同時，形成大量的 ROS，同時 NADH 再生為 NAD。糖、脂、蛋白質三大代謝物質分解中的氧化反應絕大部分通過這一體系完成。NAD(H)含量和 NADH/NAD 比值的高低可用于評價糖酵解和 TCA 循環的強弱。較高的 NAD(H)及 NADH/NAD 比值說明細胞呼吸耗氧量較高，處于過氧化狀態，NADH/NAD 比值升高也可抑制糖酵解和 TCA 循環。另外，NAD 降解產物具有非常重要的調控作用。
測定原理：
NAD 和 NADH 在 254 nm 下有吸收峰，利用液相色譜法在相應波長下測定其含量。
需自備的儀器和用品：
液相色譜儀、低速離心機、溶劑抽濾裝置、針頭式過濾器（水系，50 個，0.22μm）、濾膜（水系和有機系各 2 個，0.45μm）、C18 柱（4.6 ×150 mm）、可調式移液器、樣品瓶（50個，2mL）、乙腈（120 mL）、甲醇（色譜級，300 mL）、蒸餾水
注：若用自動進樣器，需要樣品瓶，測定時將不少于 1mL 的樣品或標準品加入樣品瓶中。無自動進樣器，需手動進樣時，不需要樣品瓶，用進樣針將不少于 20ul 的樣品或標準品打入進樣閥。
試劑的組成和配制：
試劑一：粉劑 1×1 瓶，粉劑 2×1 瓶，4℃保存；臨用前用少量蒸餾水將粉劑 1 和粉劑 2 溶解后倒入容量瓶中，用蒸餾水定容至 100mL，形成 NAD 和 NADH 提取液（注：試劑瓶中的粉劑要沖洗干凈），4℃保存 3 個月；
試劑二：粉劑 1×1 瓶，粉劑 2×1 瓶，粉劑 3×1 瓶，4℃保存；臨用前用少量蒸餾水將粉劑1、粉劑 2 和粉劑 3 溶解后倒入容量瓶中，用蒸餾水定容至 1000mL，形成流動相緩沖液基質（注：試劑瓶中的粉劑要沖洗干凈）, 4℃保存 3 個月。
試劑三：NAD 標準品 5mg×1 支，-20℃保存。加入 1mL 試劑一，配成 5mg/mL 溶液，現配現用，用不完的試劑-20℃保存。
試劑四：NADH 標準品5mg×1 支，-20℃保存。加入1mL 試劑一，配成 5mg/mL 溶液，現配現用，用不完的試劑-20℃保存。
實驗前的準備工作：
- 將蒸餾水 1000 mL、流動相緩沖液基質 1000 mL、甲醇 300 mL 和乙腈 120 mL 用0.45 μm 的濾膜抽濾，以除去溶劑中的雜質，防止堵塞色譜柱。（注：蒸餾水和緩沖液基質用水系濾膜抽濾，乙腈用有機系濾膜抽濾）。
- 流動相的配制：將抽濾完畢的流動相緩沖液基質 1000 mL 與乙腈配比為 9：1（v/v），即取 900mL 緩沖液基質與 100 mL 乙腈混合。[每個樣品需要約 12mL 流動相，流動相用量（mL）=12mL×樣品數量+跑基線用量（約 50mL），流動相的用量請根據樣品數量用多少配多少]。
- 將抽濾完畢的甲醇和蒸餾水配比成 100%的甲醇， 10%的甲醇，蒸餾水各 250 mL。
- 將 2 和 3 中的溶劑超聲 30min，以脫去溶劑中的氣泡，防止堵塞色譜柱。
輔酶ⅠNAD(H)的提取：
組織處理：稱取約 0.1g 組織，加入 1mL 試劑一，提取 NAD 和 NADH，20000 g，4℃離心 30 min，取上清液用 0.22μm 水系針頭式過濾器過濾后待測。
細胞處理：收集于 60 mL 細胞，離心菌體經高壓冷凍干燥 12 h 后，加入 2 mL 試劑一。超聲破壁細胞(950 W，30%，15 min，工作 1 s，間隔 2 s)，再經 10000 g 4℃離心 40min，上清用 0.22μm 水系微孔濾膜過濾后直接上柱檢測。
輔酶ⅠNAD(H)含量測定操作步驟：
- 開啟電腦、檢測器和泵，安裝上色譜柱，打開 empower 軟件，在方法組中設置進樣 量20μL，流速 0.8 mL/min，保留時間 15min，檢測波長 254nm,設置完畢保存方法組。
- 用 100%的甲醇、10%的甲醇、蒸餾水按甲醇濃度從大到小的順序洗色譜柱 30min。
- 用流動相洗柱子，待基線穩定后開始加樣。
- 加入標準品 20 μL，在 15min 內可分離 NAD 和 NADH， NAD 的保留時間在 3min左右，NADH 的保留時間在 7min 左右（柱子不同，保留時間有差異），計算不同濃度的 NAD 和 NADH 標準品的峰面積。
- 加入樣品 20 μL，在相應保留時間處檢測 NAD 和 NADH 的峰面積。
輔酶ⅠNAD(H)含量的計算：
- NAD 含量的計算
NAD 標準曲線的繪制：
將5mg/ml 的 NAD 標準品用蒸餾水分別稀釋成 110 μg/ml、80 μg/ml、50 μg /ml、和 20 μg /ml 的 NAD 標準品溶液，計算不同標準品溶液的峰面積。
計算標準曲線公式為: y = 25069χ- 26754（χ為 NAD 濃度，μ g/ml；y 為峰面積）
推出：χ=（y + 26754）÷25069（χ為 NAD 濃度，μ g/ml；y 為峰面積） NAD 含量（μg/mg prot）=（樣品峰面積+26754）÷25069÷蛋白濃度（mg/mL） NAD 含量（μg/g mass）=（樣品峰面積+26754）÷25069÷樣本鮮重（g/mL）
- NADH 含量的計算
NADH 標準曲線的繪制：
將 5mg/ml 的 NADH 標準品用蒸餾水分別稀釋成 200 μg/ml、150 μg/ml、100 μg/ml 和50 μg/ml 的 NADH 標準品溶液，計算不同標準品溶液的峰面積。
計算標準曲線公式為: y = 13275χ+35717（χ為 NADH 濃度，μ g/ml；y 為峰面積）
推出：χ=（y – 35717）÷13275（χ為 NADH 濃度，μ g/ml；y 為峰面積） NADH 含量（μg/mg prot）=（樣品峰面積 - 35717）÷13275÷蛋白濃度（mg/mL） NADH 含量（μg/g 鮮重）=（樣品峰面積 - 35717）÷13275÷樣本鮮重（g/mL）
注：標準品的稀釋倍數要根據樣品中 NAD 和 NADH 濃度確定，樣品中 NAD 和 NADH 的峰面積必須落在不同濃度的 NAD 和 NADH 標準品的峰面積之內，該標準曲線緊供參考。
