的ELISA試劑盒，杰出的儀器和正確的操作是確保ELISA檢測(cè)成果準(zhǔn)確牢靠的必要條件。ELISA的操作因固相載體的構(gòu)成不同而有所差異，國(guó)內(nèi)醫(yī)學(xué)查驗(yàn)一般均用板式點(diǎn)。
洗刷在ELISA進(jìn)程中雖不是一個(gè)反響進(jìn)程，但卻也決議著實(shí)驗(yàn)的成敗。ELSIA就是靠洗刷來到達(dá)別離游離的和結(jié)合的酶符號(hào)物的意圖。經(jīng)過洗刷以鏟除殘留在板孔中沒能與固相抗原或抗體結(jié)合的物質(zhì)，以及在反響進(jìn)程中非特異性地吸附于固相載體的攪擾物質(zhì)。聚苯乙烯等塑料對(duì)蛋白質(zhì)的吸附是普遍性的，而在洗刷時(shí)又應(yīng)把這種非特異性吸附的攪擾物質(zhì)洗刷下來。可以說在ELISA操作中，洗刷是zui主要的關(guān)鍵技術(shù)，應(yīng)引起操作者的高度重視，操作者應(yīng)嚴(yán)厲按要求洗刷，不得馬虎。
一般說來，ELISA試劑盒在5天內(nèi)測(cè)定的血清標(biāo)本可放置于4℃，超越一周測(cè)定的需低溫冰存。凍住血清融解后，蛋白質(zhì)部分濃縮，散布不均，應(yīng)充沛混勻宜輕緩，防止氣泡，可上下顛倒混和，不要在混勻器上激烈振動(dòng)。混濁或有沉積的血清標(biāo)本應(yīng)先離心或過濾，弄清后再檢測(cè)。反復(fù)凍融會(huì)使抗體效價(jià)下跌，所以測(cè)抗體的血清標(biāo)本如需保存作屢次檢測(cè)，宜少量分裝冰存。保存血清自收集時(shí)就應(yīng)留意無菌操作，也可參加適當(dāng)防腐劑試劑的預(yù)備按試劑盒說明書的要求預(yù)備實(shí)驗(yàn)中需用的試劑。ELISA中用的蒸餾水或去離子水，包含用于洗刷的，應(yīng)為新鮮的和高質(zhì)量的。自配的緩沖液使用pH計(jì)丈量較正。從冰箱中取出的實(shí)驗(yàn)用試劑應(yīng)待溫度與室溫平衡后運(yùn)用。試劑盒中本次實(shí)驗(yàn)不需用的部分應(yīng)及時(shí)放回冰箱保存。
在ELISA中一般有3次加樣步聚，即加標(biāo)本，加酶結(jié)合物，加底物。加樣時(shí)應(yīng)將所加物加在LEISA板孔的底部，防止加在孔壁上部，并留意不行濺起，不行發(fā)作氣泡。加標(biāo)本一般用微量加樣器，按規(guī)則的量參加板孔中。每次加標(biāo)本應(yīng)更換吸嘴，避免發(fā)作穿插污染，也可用一次性的定量塑料管加樣。有此測(cè)定（如間接法ELISA）需用稀釋的血清，可在試管中按規(guī)則的稀釋度稀釋后再加樣。也可在板孔中參加稀釋液，再在其間參加血清標(biāo)本，然后在微型震動(dòng)器上震動(dòng)1分鐘以確保混和。加酶結(jié)合物使用液和底物使用液時(shí)可用定量多道加液器，使加液進(jìn)程迅速完結(jié)。在ELISA中一般有兩次抗原抗體反響，即加標(biāo)本和加酶結(jié)合物后。抗原抗體反響的完結(jié)需要有一定的溫度和時(shí)刻，這一保溫進(jìn)程稱為溫育（incubation），有人稱之為孵育，在ELISA中似不恰當(dāng)。ELISA屬固相免疫測(cè)定，抗原、抗體的結(jié)合只在固相表面上發(fā)作。以抗體包被的夾心法為例，參加板孔中的標(biāo)本，其間的抗原并不是都有平等的和固相抗結(jié)合的機(jī)會(huì)，只要zui靠近孔壁的一層溶液中的抗原直接與抗體觸摸。這是一個(gè)逐漸平衡的進(jìn)程，因而需經(jīng)分散才干到達(dá)反響的結(jié)尾。在這以后參加的酶符號(hào)抗體與固相抗原的結(jié)合也相同如此。這就是為什么ELISA反響總是需要一定時(shí)刻的溫育。溫育常選用的溫度有43℃、37℃、室溫文4℃（冰箱溫度）等。37℃是實(shí)驗(yàn)室中常用的保溫溫度，也是大多數(shù)抗原抗體結(jié)合的適宜溫度。
在樹立ELISA試劑盒方法作反響動(dòng)力學(xué)研討時(shí)，實(shí)驗(yàn)標(biāo)明，兩次抗原抗體反響一般在37℃經(jīng)1-2小時(shí)，產(chǎn)物的生成可達(dá)高峰。為加快反響，可進(jìn)步反響的溫度，有些實(shí)驗(yàn)在43℃進(jìn)行，但不宜選用更高的溫度。抗原抗體反響4℃更為*，在放射免疫測(cè)定中多使反響在冰箱中，以構(gòu)成zui多的沉積。但因所需時(shí)刻太長(zhǎng)，在ELISA中一般不予選用。
會(huì)員1.png)