1、預先配制凍存液：

凍存液比例多種，根據細胞的特性進行調整凍存液的比例：

5%—10%DMSO + 20%—90%血清 + 0%—70%基礎培養液；

2、取對數生長期的細胞，去除舊培養液，用PBS清洗1-2次；去掉培養瓶里的殘余血清；

3、細胞消化0.5-2min（具體時間根據鏡下形態判斷），顯微鏡下觀察細胞，細胞胞質回縮，細胞間不再連接成片，此時加入*培養基終止消化；

4、用巴氏吸管輕輕吹打細胞，形成細胞懸液，將細胞懸液1000r/min左右條件下離心3-5min；

5、棄上清，加入適量預先配制好的凍存液，巴氏吸管輕輕吹打使細胞均勻，計數，調節凍存液中的細胞密度為5×106/ml～1×107/ml；

6、將細胞分裝入凍存管中，每管1-1.5ml；

7、凍存管標記細胞名稱，凍存時間，操作者及細胞代數信息。對于懸浮細胞凍存，則直接收集離心細胞，其他步驟相同。

注意事項:

1、需凍存保種的細胞應在生長良好且存活率高，其密度約為80-90％的狀態。細胞凍存前應保證細胞的活力好，無污染。

2、在細胞凍存過程中，所結的冰晶對細胞傷害較大，所以過程一定要慢。凍存或者復蘇用新配制的

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