孔雀石綠（MG）快速檢測試劑盒使用說明書

【產品簡介】

孔雀石綠因有非常好的抗菌作用和藥動力學的特性，曾經被廣泛應用，殘留危害人類健康，現已禁用。

孔雀石綠快速檢測試劑盒具有方便、快速、靈敏等特點，適用于動物組織（水產、雞、豬、牛）、牛奶、飼料等大批量樣品中的孔雀石綠快速檢測。

【測定原理】

本試劑盒采用間接競爭ELISA方法，在微孔條上預包被偶聯抗原，樣本中的殘留物孔雀石綠和微孔條上預包被的偶聯抗原競爭孔雀石綠抗體，加入酶標記物后，用TMB底物顯色，樣本吸光值與其所含殘留物孔雀石綠的含量成負相關，與標準曲線比較可得出相應殘留物孔雀石綠的含量。

【試劑盒技術指標】   

規       格：96孔/盒

靈 敏 度： 0.05ppb

檢測時間： 75min

孔雀石綠（MG）快速檢測試劑盒使用說明書樣本檢測下限：

組織\水樣…………………………………………0.5ppb

飼         料…………………………………………1ppb

參考標準GB/T 20361-2006組織檢測下限為0.5ppb

交叉反應率：

顯性孔雀石綠……………………………………99%

隱性孔雀石綠(氧化后） ………………………  95%

回收率：

組織……………………………………………75±10%

水樣 ……………………………………………80±10%

飼料……………………………………………75±10%

【試劑盒組成】   

• 微量測試孔：每條8孔，一板12條
• 標準溶液X6瓶：（1ml/瓶）0ppb、0.05ppb、0.15ppb、0.45ppb、1.35ppb、4.05ppb
• 高濃度標準品：×1瓶：（1ml/瓶） 100ppb
• 酶標記物       12ml…………………………紅色帽
• 抗體工作液     7ml…………………………綠色帽
• 底物液 A液    7ml…………………………棕色帽
• 底物液 B液    7ml…………………………黑色帽
• 終 止 液          7ml…………………………黃色帽
• 20X濃縮洗滌液40ml……………………白色帽
• 2X濃縮復溶液  50 ml…………………… 藍色帽
• 30X濃縮樣品提取液 10 ml…………………黑色帽
• 氧化劑                   2 ml…………………… 藍色管

【實驗前溶液配制】

配液1、將2X濃縮復溶液用去離子水按照1：1稀釋（1 份濃縮復

溶液+1份去離子水）用于樣本的復溶。

配液2、將40ml濃縮洗滌液（20倍濃縮）用去離子水按照1：19

稀釋（1份濃縮洗滌液+19份去離子水），或按 所需用量

配制洗滌液。

配液3、將30X濃縮樣品提取液用去離子水按照1：29稀釋（1份

濃縮洗滌液+29份去離子水），或按所需用量配制洗滌液。

【所用儀器、試劑】   

儀        器：微孔板酶標儀450nm/630nm、旋轉蒸發儀/氮氣吹干裝

置、均質器、振蕩器、離心機、刻度移液管、天平（感量0.01g ）

微量移液器：單道 20µl～200µl、100µl～1000µl、多道 250µl

試            劑：乙腈、中性氧化鋁

【樣本前處理步驟】   

孔雀石綠（MG）快速檢測試劑盒使用說明書樣本處理前須知

處理任何樣本時，都必須注意：

(1) 實驗中必須使用一次性吸頭，在吸取不同的試劑時要更換吸頭（2）實驗前須檢查各種實驗器具是否干凈，必要時對實驗器具進 行清潔，避免污染干擾實驗結果。   

樣本處理方法

（a）組織樣品處理方法：

• 稱取5±0.05g組織樣品于50ml離心管中，先加入3ml已稀釋好的樣品提取液震蕩2min；再加入10ml乙腈，充分震蕩5min，
• 加入2g中性氧化鋁；震蕩2min ，室溫4000r/min以上，離心10min；；
• 取6ml上清液于干凈離心管中，加入5ml二氯甲烷震蕩3min ，室溫4000r/min以上，離心10min；；
• 取下層清澈液體于玻璃管中，加入20ul氧化劑混勻，在56℃條件下氮氣或空氣流吹至*干燥；
• 加入1ml復溶液，充分溶解干燥殘留物。
• 取100ul 上清液與100ul 已稀釋好的復溶液充分混合30s，
• 取50ul進行分析。

        樣本稀釋倍數： 1倍

（b）水樣品處理方法：

1. 取50ul 上清液與450ul 已稀釋好的復溶液充分混合30s，
2. 取50ul進行分析。

      樣本稀釋倍數：10倍

注意：此方法所得到的結果為孔雀石綠；隱性孔雀石綠的總量

【酶標免疫分析程序】

操作步驟：

• 從4℃冷藏環境中取出所需試劑，置室 溫（20-25℃）平衡30min以上，注意每種液體試劑使用前均須搖勻。
• 取出框架及需要數量的微孔，將不用的微孔放入自封袋，保存于2-8℃。
• 編號：將樣本和標準品對應微孔按序編號，每個樣本和標準品做2孔平行，并記錄標準孔和樣本孔所在的位置。
• 加標準品或樣本50µl/孔到各自的微孔中，然后加抗體50µl/孔，用蓋板膜封板，輕輕振蕩混勻。25℃環境中反應30min。
• 取出將孔內液體甩干，用洗液250µl /孔，洗板4－5次，每次間隔15-30s，用吸水紙拍干（拍干后未被清除的氣泡可用干凈的槍頭刺破）。
• 每孔加入酶標記物100µl，蓋板膜蓋板后置25℃環境中反應30min。取出將孔內液體甩干，用洗液250µl /孔，洗板4－5次，每次間隔15-30s，用吸水紙拍干（拍干后未被清除的氣泡可用干凈的槍頭刺破）。
• 顯色：每孔加入底物液A液50µl， 再加B液50µl，輕輕振蕩混勻，25℃環境中避光顯色15min。
• 測定：每孔加入終止液50µl，輕輕振蕩混勻，設定酶標儀于450nm處（建議用雙波長450/630nm檢測，在5min內讀完數據），測定每孔OD值。

【結果判定】

結果判定有兩種方法，粗略判定可用第1種方法，定量判定用第2種方法。注意樣本吸光值與孔雀石綠的含量成負相關。

1、粗略判定：

    用樣本的平均吸光度值與標準值比較即可得出其濃度范圍(ng/ml)。假設樣本1 的吸光度值為0.310，樣本2 的吸光度值為1.051，標準液吸光度值分別是：0ppb 為2.243； 0.05ppb 為1.816；0.15ppb 為1.415；0.45ppb 為0.74；1 .35ppb 為0.343；4 .05ppb 為0.155。則樣本1 的濃度范圍是1.35ppb～4.05ppb；樣本2的濃度范圍是0.15ppb～0.45ppb。乘以其對應的稀釋倍數即為樣本中孔雀石綠的實際含量。

2、定量判定：

所獲得的每個濃度標準溶液和樣本吸光度值的平均值（B）除以*個標準（0標準）的吸光度值（B₀）再乘以99%，即：

B—標準溶液或樣本溶液的平均吸光度值

B₀—0ng/ml標準溶液的平均吸光度值

以標準品百分吸光率為縱坐標，以孔雀石綠標準品濃度（ng/ml）的半對數為橫坐標，繪制標準曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標準曲線中，從標準曲線上讀出樣本所對應的濃度，乘以其對應的稀釋倍數即為樣本中孔雀石綠實際濃度。

若利用試劑盒專業分析軟件進行計算，更便于大量樣品的準確、快速分析。

孔雀石綠（MG）快速檢測試劑盒使用說明書3、標準準曲線：

B/B0 (%)

 0.05      0.15       0.45        1.35      4.05

                 孔雀石綠(ppb) [µg/kg]

            圖1：孔雀石綠檢測試劑盒的回歸曲線

4、再現性：

%CV 

   0       0.05    0.15     0.45    1.35    4.05

             孔雀石綠 (ppb) [µg/kg]

         圖2：孔雀石綠檢測試劑盒的精密度

由多個不同的實驗結果確定了精密度，圖2顯示出孔雀石綠檢測試劑盒的精密度情況，獲得的標準吸收值的變異系數（%CV）對相應孔雀石綠濃度作曲線，可以看到在全部范圍內變異系數如此之低，可以得到很好的再現性。

【注意事項】

• 使用前將所有試劑溫度回升至室溫20-25℃。試劑及標本沒有回到室溫（20-25℃）會導致所有標準的OD值偏低。
• 在洗板過程中如果出現板孔干燥的情況，則會伴隨著出現標準曲線不成線性，重復性不好的現象。所以洗板拍干后應立即進行下一步操作。
• 混合要均勻，否則會出現重復性不好的現象。
• 反應終止液為2M硫酸，避免接觸皮膚。
• 不要使用過了有效日期的試劑盒，稀釋或攙雜使用會引起靈敏度、OD值的變化。不要交換使用不同批號的盒中試劑。
• 不用的微孔板放進自封袋密封；標準物質和無色的發色劑對光敏感，因此要避免直接暴露在光線下。
• 顯色液若有任何顏色表明變質，應當棄之。0標準的吸光度值小于0.5個單位（A_450nm< 0.5 ）時，表示試劑可能變質。
• 該試劑盒反應溫度為25℃，溫度過高或過低將導致檢測吸光度值和靈敏度發生變化。

【儲存】

原包裝應儲存于2～8℃保鮮冷藏，切勿冷凍。

【有效期】

有效期12個月;生產日期、有效期、生產批號見外包裝。

孔雀石綠（MG）快速檢測試劑盒使用說明書齊一生物專業供應