雙重免疫組化的步驟、原理及注意事項

雙重免疫組化的步驟: 
1、切片脫蠟至水 
2、阻斷內源性過氧化物酶(198毫升甲醇或水+2毫升30% H2O2)室 溫20分鐘。 
3、pH7.2緩沖液洗三次。 
4、胰蛋白酶消化37 ℃，30分鐘。（或按說明書要求：放入抗原修復液內微波修復20分鐘、或電爐加熱30分鐘、或高壓鍋加帽出氣后3分鐘，快速冷卻；或不處理） 
6、滴加正常血清37 ℃，30分鐘。（可不用） 
7、擦去多余血清，加一抗37 ℃，30分鐘。 
8、pH7.2緩沖液洗三次。 
9、滴加生物素化二抗，37 ℃，30分鐘。 
10、pH7.2緩沖液洗三次。 
11、滴加ABC或S-P復合物，37 ℃，45分鐘。 
12、pH7.2緩沖液洗三次。 
13、DAB或（BCIP/NBT紫藍色）顯色3～10分鐘。 
14、pH7.2緩沖液洗三次。 
15、雙標阻斷液，10分鐘（可不用） 
16、滴加正常血清37 ℃，30分鐘。（可不用） 
17、擦去多余血清，加第二種一抗37 ℃，30分鐘。 
18、pH7.2緩沖液洗三次。 
19、滴加生物素化二抗，37 ℃，30分鐘。 
20、滴加堿性磷酸酶復合物，37 ℃，30分鐘。 
21、AEC顯色 
22、水洗 
23、蘇木素淡染，藍化，脫水，透明，封固

原理:
雙重免疫組化是科研中的較好的一種免疫組化方法，其原理就是根據陽性表達部位和陽性表達區域不同所建立的一種直觀的多色定位的染色方法。其標記的對象是兩種或兩種以上的細胞部位。主要標記部位如下： 
1.膜+漿型 
2.膜+核型 
3.漿+核型 

切不可膜+膜，核+核，以免影響效果和顏色重疊。由于HRP和AEC顯色系統 

的肉眼鏡下顏色不同，所以直接抗原定位表達就非常直觀了。 

注意事項： 

1.玻片的處理 雙重免疫組化步驟繁多，兩次熱修復對玻片涂膠要求較 高，以免脫片。 

2.由于兩種顯色系統顏色可能產生重疊，所以應該先讓不容易顯的放在前面，容易出色的放在后面。無特別說明，還是先出HRP系統，后AEC系統。 

3.雙重染色要有目的性，不可盲目雙重染色造成結果無說服意義。 

雙重染色的應用： 

1.用于區分常規HE染色下教難辨別的部位，例如，脈管系統中淋巴管道和 血管管腔無法肉眼區分。 

2.惡性腫瘤的擴散顯示。惡性腫瘤細胞的浸潤在正常黏膜下呈慢性吞噬，如果對上皮和腫瘤細胞同時標記，可以更直接的觀察滲透情況。 

3.不同細胞在同一區域的分布情況