異硫氰酸熒光素是一種熒光試劑，發(fā)射綠色熒光。該分子中含有活潑的異硫氰酸基團(tuán)，易于與蛋白質(zhì)等分子反應(yīng)，常用于蛋白質(zhì)的熒光標(biāo)記等。 能與抗體結(jié)合的一種熒光指示劑。用于熒光顯微鏡觀察。
異硫氰酸熒光素純品為黃色或橙黃色結(jié)晶粉末，易溶于水和酒精溶劑。有兩種異構(gòu)體，其中異構(gòu)體Ⅰ型在效率、穩(wěn)定性與蛋白質(zhì)結(jié)合力等方面都更優(yōu)良。FITC分子量為389.4，zui大吸收光波長(zhǎng)為490～495nm，zui大發(fā)射光波長(zhǎng)為520～530nm，呈現(xiàn)明亮的黃綠色熒光。
異硫氰酸熒光素在冷暗干燥處可保存多年，是目前應(yīng)用zui廣泛的熒光素。其主要優(yōu)點(diǎn)是人眼對(duì)黃綠色較為敏感，通常切片標(biāo)本中的綠色熒光少于紅色。 FITC能和各種抗體蛋白結(jié)合，結(jié)合后的抗體不喪失與一定抗原結(jié)合的特異性，并在堿性溶液中具有強(qiáng)烈的黃綠色熒光。通過(guò)在熒光顯微鏡下觀察或流式細(xì)胞儀分析可對(duì)相應(yīng)抗原進(jìn)行定性、定位或定量的檢測(cè)。用于醫(yī)學(xué)，農(nóng)學(xué)和畜牧等方面，可對(duì)由地細(xì)菌病毒和寄生蟲(chóng)等所致疾病進(jìn)行快速診斷。
異硫氰酸熒光素標(biāo)記抗體流程：
（1）將待交聯(lián)的蛋白（濃度≥1mg/ml）對(duì)交聯(lián)反應(yīng)液透析三次4℃，至pH＝9.0。交聯(lián)反應(yīng)液配制方法：7.56g NaHCO3，1.06g Na2CO3，7.36g NaCl，加水定容至1 L。
（2）將FITC溶于DMSO中，濃度為1mg/mL。每次交聯(lián)使用的FITC均應(yīng)新鮮配制，避光。
（3）按P:F（蛋白質(zhì):FITC）=1mg:150μg 的比例將FITC緩慢加入于抗體溶液中，邊加邊輕輕晃動(dòng)使其與抗體混合均勻，暗處4 ℃反應(yīng)8 h。
（4）加入5mol/L的NH4Cl至終濃度50mmol/L， 4 ℃終止反應(yīng)2 h。
（5）將交聯(lián)物在PBS中透析四次以上，至透析液清亮。
（6）交聯(lián)物的鑒定
蛋白濃度（mg/mL） = [ A280– 0.31×A495 ] / 1.4
F/P比例: 3.1×A495 / [A280 – 0.31×A495 ]，該值應(yīng)介于2.5 ~ 6.5之間。
（7）FITC交聯(lián)的蛋白應(yīng)置于pH 7.4的磷酸鹽緩沖液中，加入0.1% NaN3、1% BSA，4℃避光保存。
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