培養(yǎng)基上皮細胞及內(nèi)皮細胞蛋白胨的培養(yǎng)步驟

    上皮細胞蛋白胨包括腺上皮是很多器官如肝、胰、乳腺等的功能成分，又由于癌起源于上皮組織，故上皮細胞培養(yǎng)特別受到重視。但上皮細胞培養(yǎng)中常混雜有成纖維細胞，培養(yǎng)時生長速度往往超過上皮細胞，并難以純化，同時上皮細胞難以在體外長期生存，因此純化和延長生存時間是培養(yǎng)關(guān)鍵。

　　體內(nèi)上皮細胞生長在膠原構(gòu)成的基膜，因此培養(yǎng)在有膠原的底物上可能利于生長，另外人或小鼠表皮細胞培養(yǎng)在以3T3細胞為飼養(yǎng)層（用射線照射后）時，細胞易生長并可發(fā)生一定程度的分化現(xiàn)象。降低PH、Ca2+含量和溫度，向培養(yǎng)基中加入表皮生長因子，均有利于表皮細胞生長。

　　以表皮細胞為例，用皮膚表皮和分離培養(yǎng)法可獲得純上皮細胞，其法如下（黑木凳志夫1981）

　　1、取材：外科植皮或手術(shù)殘余皮膚小塊，早產(chǎn)流產(chǎn)兒皮膚更好，取角化層薄者，切成0.5－1平方厘米小塊。

　　2、置0.02%EDTA中，室溫，5分鐘。

　　3、換入0.25%*中，4℃過夜。

　　4、分離：取出皮塊，用*或鑷子將表皮與層分開。

　　5、取出表皮，剪成更小的塊后，置0.25%*中，37℃，30—60分鐘。

　　6、反復(fù)吹打，制成懸液。

　　7、培養(yǎng)：用80目不銹鋼紗網(wǎng)濾過后，低速離心，吸去上清。

　　8、直接加入蛋白胨（Eagle加20%小牛血清）制成細胞懸液，接種入培養(yǎng)瓶，CO2溫箱培養(yǎng)。

    內(nèi)皮細胞易于從大血管分離培養(yǎng)成單層細胞，對于研究內(nèi)皮細胞再生、腫瘤促血管生長因子（TAF）等有很大價值。

　　研究人內(nèi)皮蛋白胨細胞培養(yǎng)以人臍帶靜脈灌流消化法zui為簡便，其法如下：

　　1、產(chǎn)后新鮮臍帶，無菌剪取10—15厘米長一段，如不能立即培養(yǎng)，可于12小時內(nèi)保存于4℃。

　　2、用三通注射器吸取溫PBS液注入臍靜脈中洗去殘血，在入口處用線繩扎緊，以防液體返流。

　　3、用*夾緊臍帶一端，從另一端向臍靜脈中徐徐注入終濃度為0.1%的粗制膠原酶，充滿血管，消化3—10分鐘；注入口用線繩扎，以防液體返流。

　　4、吸出含有內(nèi)皮蛋白胨細胞的消化液，于離心管中，注入溫PBS輕輕反復(fù)沖洗后，一并注入離心管中（此步驟可重復(fù)）。5、離心去上清，加入RPMI1640培養(yǎng)液制成細胞懸液，接種入培養(yǎng)器皿中，置溫箱培養(yǎng)。兩至三天可見細胞長成單層。