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重組人乙酰膽堿酯酶治療有機磷效果研究
2013-11-27 閱讀(722)
對重組人乙酰膽堿酯酶其分子特性和生物學特性進行篩選。
為進一步rhAChE的體內研究及臨床應用奠定基礎,從而為有機磷中毒開辟新的治療途徑。 根據疼痛基因庫的基因序列，用引物primier5軟件和合成正常流產哈赫基因特異性擴增引物設計，胎兒大腦總RNA提取的RNA為模板，,利用RT-PCR技術擴增出hAChE ,將純化的PCR擴增產物與克隆載體pUCm-T連接,構建克隆表達載體,將其命名為pUCm-T/AChE,轉化到大腸桿菌DH5α感受態細胞中,經IPTG誘導培養,白色菌落篩選，質粒DNA小量提取，測定并分析了消化和雙酶序列的PCR鑒定。
用限制性內切酶EcoR I和Xho I酶切克隆載體pUCm-T/AChE,回收AChE基因片段,并與經同樣酶切的pET-28a（+）表達載體連接,構建重組質粒,將其命名為pET-AChE,轉化大腸桿菌BL21中,通過Kan+篩選陽性質粒,進行PCR鑒定,將BL21（pET-AChE）工程菌經IPTG誘導表達,將誘導及未誘導的工程菌全菌蛋白進行SDS-PAGE電泳檢測。根據改良埃爾曼法（比色法）人血乙酰膽堿酯酶和rHAChE活性檢測，比較。
重組人乙酰膽堿酯酶治療有機磷研究結果。
采用紫外分光光度計測量的總RNA提取，OD260／od2801.8，OD260／od2701.2，表明游離酚殘留蛋白。取lulRNA樣品做甲醛變性凝膠電泳可見28S和18SRNA兩條帶,說明RNA基本完整。克隆的hAChE編碼序列為1845bp,與GenBank DNA數據庫中人乙酰膽堿酯酶基因序列一致。構建了克隆表達載體pUCm-T/AChE和重組表達載體pET-AChE。SDS-PAGE電泳和Western blot分析表明，分子量約為68.2kda rHAChE，0.75mg/ml的濃度。
