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上海博湖生物科技有限公司
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PCR反應條件如何配置
2024-11-4 閱讀(207)
PCR反應條件為溫度、時間和循環次數。
溫度與時間的設置：基于PCR原理三步驟而設置變性-退火-延伸三溫度點。在標準反應中采用三溫度點法，雙鏈DNA在90～95℃變性，再迅速冷卻至40 ～60℃，引物退火并結合到靶序列上，然后快速升溫至70～75℃，在Taq DNA 聚合酶的作用下，使引物鏈沿模板延伸。對于較短靶基因（長度為100～300bp時）可采用二溫度點法，除變性溫度外、退火與延伸溫度可合二為一，一般采用94℃變性，65℃左右退火與延伸（此溫度Taq DNA酶仍有較高的催化活性）。PCR反應條件配置如下：
1. PCR反應的緩沖液提供合適的酸堿度與某些離子 。
2. 鎂離子濃度總量應比dNTPs的濃度高，常用1.5 mmol/L。
3. 底物濃度dNTP以等摩爾濃度配制，20～200 umol/L。
4. TaqDNA聚合酶2.5U(100 ul）。
5. 引物 濃度一般為0.1 ～0.5 umol/L。
6. 反應溫度
（1）變性溫度和時間95℃，30 s。
（2）退火溫度和時間 低于引物Tm值5 ℃左右，一般在45～55℃。
（3）延伸溫度和時間72℃，1 min/kb(10 kb內）。
（4）Tm值=4(G+C) +2(A+T)。
7. 循環次數
一般為25 ～30次。循環數決定PCR擴增的產量。模板初始濃度低，可增加循環數以便達到有效的 擴增量。但循環數并不是可以無限增加的。一般循環數為30個左右，循環數超過30個以后，DNA聚合酶活性逐漸達到飽和，產物的量不再隨循環數的增加而增加，出現了所謂的“平臺期"。
