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細胞CDK1/CYCLIN B激酶活性光度法定量檢測試劑盒說明書

時間:2024/7/29閱讀:1328
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細胞CDK1/CYCLIN B激酶活性光度法定量檢測試劑盒產品說明書

 

主要用途

 

細胞CDK1/CYCLIN B激酶活性光度法定量檢測試劑是一種旨在通過多肽底物,受到CDK1/CYCLIN B酸化后,進而由丙酮酸激酶和乳酸脫氫酶連續循環法反應系統,測定產生ADP過程中,伴隨的還原型腺嘌呤二核苷酸(NADH)的氧化反應, 即采用光度法測定其氧化后峰值的變化,以分析細胞裂解樣品中CDK1/CYCLIN B特異活性的而經典的技術方法。該技術經過精心研制、成功實驗證明的其適用于各種細胞裂解萃取液樣品(動物、人體)、部分或純化酶樣品中CDK1/CYCLIN B激酶的特異活性定量檢測,以及抑制劑和激活劑的篩選。產品嚴格無菌,即到即用,操作簡捷,性能穩定,高度敏感。

 

技術背景

 

細胞周期素依賴性激酶1cyclin dependent kinase 1CDK1),又稱為細胞分裂周期蛋白2cell division cycle2CDC2)或p34cdk1,屬于激酶(serine/threonine protein kinase)家屬成員之一。其為高度進化保留的激酶復合物,成熟促進因子(maturation promoting factorMRF)中的催化亞體,含有297氨基酸,與細胞周期素B結合,允許細胞由G2期進入有絲分裂期以及由G1期進入DNA合成期,達到調節細胞生長、DNA復制、細胞分裂等。其磷酸化目標序列為 GGGRSPGRRRRK基于底物GGGRSPGRRRRK,在ATP的存在下,受到CDK1/CYCLIN B激酶的磷酸化,獲得產物磷酸化多肽,進而通過丙酮酸激酶(pyruvate kinasePK)和乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenaseLDH)反應系統中,還原型腺嘌呤二核苷酸(reduced nicotinamide adenine dinucleotideNADH)轉化為氧化型腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotideNAD),其吸光峰值的變化340nm,來定量分析細胞周期素依賴性激酶1/細胞周期素B的特異活性其反應方式為:

 

產品內容

 

清理液(Reagent A         毫升

裂解液(Reagent B         毫升

緩沖液(Reagent C          毫升

酶促液(Reagent D          微升

反應液(Reagent E          微升

底物液(Reagent F         微升

陰性液(Reagent G          微升

產品說明書               1

 

保存方式

 

保存清理液(Reagent A4冰箱里;其余的保存在-20冰箱里,嚴格避免光照和反復凍融;有效保證6

 

用戶自備

 

CDK1/CYCLIN B激酶:用于抑制劑篩選

1.5毫升離心管:用于樣品保存的容器

15毫升錐形離心管:用于樣品處理的容器

細胞刮脫棒:用于貼壁細胞脫離

(微型)臺式離心機:用于細胞預處理

100微升1厘米光徑比色皿或96孔板:用于光度分析操作的容器

分光光度儀或酶標儀:用于樣品光度分析

 

實驗步驟

 

一、 待測樣品準備

 

1. 準備好25cm2細胞培養瓶或60mm細胞培養皿的待測培養細胞(15 X 106細胞)

2. 小心加入xx毫升清理液(Reagent A,覆蓋生長表面

3. 小心抽去清理液

4. 使用細胞刮脫棒輕柔刮脫細胞(注意:避免使用消化

5. 加入xx毫升清理液(Reagent A,混勻細胞

6. 移入到預冷的15毫升錐形離心管(注意:懸浮細胞從這一步驟開始

7. 放進4℃臺式離心機離心5分鐘,速度為300g

8. 小心抽去上清液

9. 加入xx微升裂解液(Reagent B,充分混勻

10. 轉移到預冷的1.5毫升離心管

11. 強力渦旋震蕩15

12. 置于冰槽里孵育30分鐘

13. 放進4℃微型臺式離心機離心5分鐘,速度為16000g(或13000RPM,例如eppendorf 5415

14. 小心移取500微升上清液到新的預冷的1.5毫升離心管

15. 移取10微升進行蛋白定量檢測(注意:建議使用 Bradford蛋白質濃度定量試劑盒-30030.1

16. 即刻放進-70保存或置于冰槽里繼續后續操作

 

二、 測定準備

 

1. 準備好待測樣品(例如細胞裂解懸液等),置于冰槽里 

2. 設定好分光光度儀(溫度為30℃):波長為340nm,間隔1分鐘,讀數6次(共5分鐘),并置零

三、 背景對照測定

 

1. 移取65微升緩沖液(Reagent C到新的比色皿

2. 加入10微升酶促液(Reagent D

3. 加入10微升反應液(Reagent E

4. 加入10微升底物液(Reagent F

5. 放進30培養箱里靜置3分鐘

6. 加入5微升陰性液(Reagent G

7. 上下傾倒數次,混勻(限定在3秒之內)

8. 即刻放進分光光度儀檢測,此為背景空對照:340波長讀數0分鐘 340波長讀數5分鐘

 

四、 樣品測定

 

1. 移取xx微升緩沖液(Reagent C到新的比色皿

2. 加入xx微升酶促液(Reagent D

3. 加入xx微升反應液(Reagent E

4. 加入xx微升底物液(Reagent F

5. 放進30培養箱里靜置3分鐘

6. 加入5微升待測樣品(注意:50微克細胞裂解蛋白;樣品須溶解

7. 上下傾倒數次,混勻(限定在3秒之內)

8. 即刻放進分光光度儀檢測,此為樣品總活性讀數:340波長讀數0分鐘 340波長讀數5分鐘

 

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